Tạo dòng và biểu hiện interleukin 29 người tái tổ hợp ứng dụng trong điều trị

Tóm tắt

Từ năm 1991, Cơ quan quản lý Dược phẩm và Thực phẩm Hoa Kỳ (FDA) đã chấp nhận việc sử dụng một số IFN để chữa trị một số bệnh do virus viêm gan gây ra. Những sản phẩm này bao gồm interferon 2b (Intron A), interferon 2a (Roferon), consensus interferon (Infergen) và gần đây là PEG-IFNα2a kết hợp với ribavirin (RBV) được sử dụng trong điều trị HBV và HCV mạn tính. Tuy nhiên, một số bệnh nhân không đáp ứng với liệu pháp điều trị này hoặc không chịu được những tác dụng phụ của thuốc như triệu chứng sốt giả cúm, vỡ hồng cầu dẫn đến thiếu máu hoặc liên quan đến tiêu hóa, thần kinh nên không tiếp tục điều trị.

      Năm 2009, nghiên cứu về di truyền học đã phát hiện ra những khác biệt trên gen IL-28B (IFN nhóm III) có liên quan đến việc không đáp ứng thuốc của một số bệnh nhân viêm gan C mãn tính với liệu pháp điều trị hiện hành (PEG-IFNα2a + ribavirin). Interleukin-29 (IL-29) (hay có tên khác là interferon lambda 1), cũng thuộc IFN nhóm III, có trình tự amino acid giống với trình tự của IL-28. IL-28 và IL-29 được phân chia nhận dạng trình tự với các IFN type 1 và gắn kết với một thụ thể mới trên bề mặt tế bào bao gồm IFNLR1 và IL10R2. Chúng là một trong các cytokin mới ở người được phân loại dựa trên thụ thể trên bề mặt của tế bào mà chúng gắn kết, giống về cấu trúc với IL-10 và có một số đặc điểm chung với IFN nhóm I như: kháng khả năng tăng sinh tế bào, hoạt tính kháng virus và kháng ung thư in vitro. Các nghiên cứu đã cho thấy, việc điều trị bằng IL-29 sẽ giải quyết được vấn đề không đáp ứng thuốc của một số bệnh nhân viêm gan C mãn tính.

      Tuy nhiên, tại Việt Nam, protein IL-29 hầu như chưa được nghiên cứu và sản xuất rộng rãi. Do đó, nghiên cứu này sẽ bước đầu nghiên cứu việc sản xuất protein IL-29 nhằm mục đích tạo nguồn nguyên liệu sản xuất PEG-IL29 phục vụ nhu cầu điều trị viêm gan C mãn tính cũng như những nghiên cứu về sau.

      Nguyên liệu:

      Chủng vi sinh vật E. coli TOP10F' [{lacI^q Tn10 (Tet^R)} mcrA ∆(mrr-hsdRMS-mcrBC) Φ80lacZ∆M15 ∆lacX74 recA1 araD139 ∆(ara-leu)7697 galU galK rpsL endA1 nupG] (Invitrogen) được sử dụng làm chủng chủ để tạo dòng và lưu trữ plasmid.

      Chủng vi sinh vật E. coli BL21 (DE3): [F^- ompT hsdS_B (r_B-m_B-) gal dcm rne131 (DE3)] (Invitrogen) được sử dụng làm chủng chủ để tạo dòng và biểu hiện protein đích dưới sự cảm ứng của IPTG (isopropyl β-D-1-thiogalactopyranosid).

      Vector pNanogen (Công ty Công nghệ Sinh học Dược Nanogen) được sử dụng để dòng hóa và biểu hiện protein tái tổ hợp, sử dụng promoter T7 và có mang gen kháng kanamycin dùng đề sàng lọc thể biến nạp.

      Tế bào Hep-2C, virus encephalomyocarditis (EMC) .

      Phương pháp nghiên cứu:

      Tạo dòng và biểu hiện protein tái tổ hợp pNanogen-IL29. Nuôi cấy và cảm ứng sinh tổng hợp protein IL-29. Tách chiết và tinh sạch protein tái tổ hợp. SDS-PAGE và lai Western blot. Thử nghiệm ELISA. Xác định hoạt tính của protein rh-IL29

      Kết quả:

      Đoạn gen mã hóa cho protein IL-29 người đã được tạo dòng thành công vào vi khuẩn E. coli tạo ngân hàng chủng gốc phục vụ nghiên cứu và sản xuất. Quá trình khảo sát cho thấy chủng này có khả năng biểu hiện protein mục tiêu IL-29 cao nhất trong môi trường LB_kan, nuôi cấy lắc 200 vòng/phút tại nhiệt độ 37^oC bởi chất cảm ứng IPTG nồng độ 1 mM và thời gian nuôi cấy sau cảm ứng là 4 giờ. Protein IL-29 được tinh sạch bằng phương pháp FPLC, protein thu được sau tinh chế có độ tinh sạch đạt ≥ 95 %, nồng độ protein > 1 mg/ml, pH nằm trong khoảng 6,5 - 7,5, trọng lượng phân tử 18-20 kDa, không lẫn DNA hay peptid tồn dư từ tế bào chủ E. coli, không có nội độc tố vi khuẩn. Hiệu quả bảo vệ tế bào Hep-2C với virus thử thách encephalomyocarditis (EMC) có ED50 đạt 2,86 ng/ml.