Nghiên cứu chiết và tinh chế độc tố tetrodotoxin từ phủ tạng một số loài cá nóc độc (Tetraodontidae) của vùng biển Việt Nam

Tóm tắt

Tetrodotoxin (TTX) là một độc tố thần kinh không protein (neurotoxin nonprotein), một trong những độc tố tự nhiên có độc tính cao nhất (LD₅₀ = 8-11 µg/kg) với liều gây chết cho người 1 - 2 mg qua đường tiêu hóa. TTX được tìm thấy trong nhiều loài khác nhau, bao gồm cá nóc, cá bống, sa giông, cóc (ếch độc) và bạch tuộc vòng lam. Cá nóc, đặc biệt trứng của nó, là nguồn TTX được biết tới nhiều nhất. Hợp chất này có thể gây tê liệt thần kinh do có tác dụng chẹn kênh vận chuyển natri (sodium carrying system) nhưng không ảnh hướng đến kênh vận chuyển kali (potassium carrying system). Do ái lực mạnh và có tác dụng chẹn kênh natri một cách đặc hiệu, dẫn tới làm tê liệt dẫn truyền thần kinh, TTX thể hiện tác dụng giảm đau trung ương rất mạnh. Gần đây, trên thế giới cũng như ở Việt Nam, TTX và những chất tương tự TTX (TTX analogues) như: 4- epi TTX, 4-epi anhydro TTX... đang được thử nghiệm như một chất dẫn đường (lead compound) tiềm năng hướng tới điều trị một số bệnh hiểm nghèo như như bệnh tim mạch, giảm đau trong ung thư, cai nghiện ma tuý vv... Goto và CS (1963), Tsuda và CS (1964) đã xác định được cấu trúc hoá học của TTX là dẫn xuất của aminoperhydroquinazolin (C₁₁H₁₇O₈N₃; M = 319). Để phục vụ nghiên cứu về độc tính cá nóc và ứng dụng của TTX trong y học, cần phải có chất chuẩn đối chiếu hóa học tetrodotoxin. Cho đến nay, ở Việt Nam chưa có nghiên cứu nào chiết TTX với lượng đủ lớn và có độ tinh khiết cao để làm chất chuẩn. Chính vì thế, đã nghiên cứu chiết xuất TTX với lượng đủ lớn, và tinh chế TTX có độ tính khiết cao (≥ 95,0 %) để làm nguyên liệu thiết lập chất chuẩn.

Nguyên liệu: Một số loài cá nóc độc thu mẫu năm 2012 tại vùng biển tỉnh Khánh Hòa và Vũng Tàu, Việt Nam, được định danh làm tiêu bản và lấy phần nội tạng (trứng, gan, ruột), bảo quản ở nhiệt độ dưới -10 ^ºC.

Phương pháp nghiên cứu

+ Chiết và làm giàu mẫu (dịch chiết toàn phần có chứa TTX)

+ Phân tích xác định cấu trúc: Sản phẩm TTX tinh khiết được nhận dạng bằng đo phổ NMR (¹H-NMR, ¹³C-NMR, DEPT, HMBC, COSY) và HR FTICR - MS.

+ Định tính và định lượng tetrodotoxin: hàm lượng tetrodotoxin trong sản phẩm TTX thô và TTX sau tinh chế được xác định bằng LC - MS.

Kết quả:

Trong nghiên cứu này, đã xây dựng được quy trình chiết xuất và tinh chế tetrodotoxin đạt độ tinh khiết cao để làm nguyên liệu thiết lập chất chuẩn đối chiếu hóa học. Sau khi chiết, sơ tinh chế, thu được 137,85 mg TTX thô có độ tinh khiết 82,97 %. Quá trình tinh chế bằng sắc ký điều chế đã thu được 93,49 mg TTX tinh khiết, được định lượng bằng LC-MS cho kết quả hàm lượng đạt 98,27 %, phù hợp yêu cầu làm nguyên liệu để thiết lập chất chuẩn tetrodotoxin. Đây là lần đầu tiên TTX được tinh chế có độ tinh khiết cao ở Việt Nam, ngoài nhận dạng bằng NMR ra còn được khẳng định bẳng phổ khối phân giải cao (HR FT-ICR MS) và phổ khối với độ chính xác cao và phân giải cao (HR Acurate Orbitrap ESI MS).