Đánh giá ảnh hưởng của nồng độ calci và thông số ly tâm đến hiệu suất phân lập microsomes từ gan chuột cống

Tóm tắt

Microsomes là các cấu trúc nhỏ (đường kính ~ 20 - 200 nm) chứa nhiều enzym chuyển hóa quan trọng, trong đó có các enzym chuyển hóa thuốc cytochrom P450 (CYP450). Microsomes phân lập từ gan có vai trò quan trọng trong nghiên cứu phát triển thuốc như đánh giá chuyển hóa thuốc, đánh giá ảnh hưởng của thuốc lên CYP450.

Microsomes được tạo thành từ các mảnh vỡ của lưới nội chất sau khi tế bào bị phá vỡ. Phương pháp phổ biến nhất để phân lập microsomes là phương pháp sử dụng máy siêu ly tâm có lực ly tâm > 100000 g. Microsomes cũng có thể được phân lập bằng phương pháp kết tủa calci. Phương pháp sử dụng calci có một số ưu điểm nổi bật như: 1. Không cần sử dụng máy siêu ly tâm đắt tiền mà chỉ cần máy ly tâm có lực ly tâm < 15000 g; 2. Thời gian phân lập ngắn hơn nhưng vẫn thu được microsomes có chất lượng tương đồng với phương pháp sử dụng máy siêu ly tâm.

Cho tới nay, ở Việt Nam chưa có công bố nào về việc nghiên cứu phân lập microsomes có thể là vì hiện nay rất ít cơ sở nghiên cứu được trang bị máy siêu ly tâm đắt tiền. Trong khi đó, phân lập microsomes bằng phương pháp kết tủa calci phù hợp với điều kiện nhiều phòng thí nghiệm ở Việt Nam nhưng cũng chưa có tác giả nào nghiên cứu ứng dụng. Trên thị trường có bán microsomes của các công ty nước ngoài nhưng rất đắt (khoảng 75 USD/10 mg microsomes từ gan chuột cống). Vì vậy, xây dựng quy trình phân lập microsomes phù hợp với điều kiện nước ta là rất cần thiết để có thể cung cấp microsomes giá thành thấp phục vụ cho nghiên cứu trong nước.

Hiện nay, Trường Đại học Dược Hà Nội được trang bị máy ly tâm Supra R22 có lực ly tâm tối đa là 52000 g cho rotor 6 x 50 ml. Việc kết hợp giữa sử dụng máy ly tâm này với phương pháp kết tủa calci có thể có một số ưu điểm như thu được microsomes có hiệu suất cao và tiết kiệm thời gian. Vì vậy, nghiên cứu đánh giá ảnh hưởng của một số điều kiện phân lập (lực ly tâm, nồng độ calci, thời gian ly tâm) đến hiệu suất thu hồi microsomes để lựa chọn điều kiện phân lập phù hợp cho các nghiên cứu về microsomes tiếp theo.

      Nguyên vật liệu và trang thiết bị         

- Chuột cống 6 tuần tuổi (Viện Vệ sinh dịch tễ Trung ương, Hà Nội, Việt Nam).

- Hóa chất: Sucrose, glycerol, đệm phosphat, Tris-HCl, calci chlorid, BCA kit.

Phương pháp nghiên cứu

- Phương pháp phân lập microsomes

- Phương pháp xác định hiệu suất phân lập microsomes

- Phương pháp xử lý số liệu

      Kết luận          

Trong phương pháp phân lập microsomes có bổ sung calci: nồng độ Ca²⁺ và lực ly tâm càng cao thì hiệu suất phân lập microsomes càng cao; thời gian ly ảnh hưởng không đáng kể tới hiệu suất phân lập microsomes. Hiệu suất đạt > 18 mg protein/g gan chuột khi sử dụng Ca²⁺ ≥ 4 mM và lực ly tâm ≥ 25000 g trong 15 phút.