Tạo dòng và biểu hiện nhân tố kích thích tạo dòng bạch cầu hạt – đại thực bào HGM-CSF (human granulocyte-macrophcolony stimulating factor) tái tổ hợp trên hệ thống Pichia pastoris

Tóm tắt

Nhân tố kích thích tạo dòng bạch cầu hạt - đại thực bào GM-CSF là một glycoprotein thuộc họ CSFs (colony stimulating factors). GM-CSF người tái tổ hợp (rhGM-CSF) là một trong những sản phẩm protein tái tổ hợp hiện nay được FDA chấp thuận để điều trị các bệnh như  neutropenia, leukemia, sử dụng kết hợp với hóa trị trong điều trị ung thư,… Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành tạo dòng và biểu hiện rhGM-CSF dạng tiết trên hệ thống nấm men Pichia pastoris dưới sự điều hòa của promoter AOX1. Gen hgm-csf mã hóa cho protein hGM-CSF có kích thước 415bp được thu nhận từ  phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu hGM-F và hGM-R lần lượt mang vị trí nhận biết của enzyme XhoI và NotI. Sau khi xử lí với hai enzyme này, gen hgm-csf được chèn vào vector biểu hiện pPICZαA ngay tại vị trí XhoI và NotI. Vector pPICZαA tái tổ hợp mang gen hgm-csf đặt dưới sự kiểm soát của promoter AOX1, pPICZαA/hGM-CSF, có khả năng biểu hiện protein hGM-CSF trên hệ thống nấm men P. pastoris. Vector pPICZαA/hGM-CSF được kiểm tra bằng phương pháp PCR, cắt hạn chế và giải trình tự; kết quả giải trình tự cho thấy gen hgm-csf đồng khung dịch mã và trình tự acid amin mã hóa tương đồng 100% so với các trình tự công bố trên ngân hàng gen. Vector này sau khi xử lí với enzyme SacI được điện biến nạp vào tế bào nấm men P. pastoris X33 để tạo thành chủng tái tổ hợp P. pastoris X33::hgm-csf. Khi nuôi cấy chủng tái tổ hợp trên môi trường cảm ứng BMMY có chứa methanol, protein hGM-CSF được biểu hiện ở dạng tiết ra môi trường nuôi cấy. Kết quả phân tích SDS-PAGE và Western blot với kháng thể đặc hiệu cho thấy protein này biểu hiện ra ở cả dạng glycosyl hóa với kích thước 20 kDa, 29-35 kDa, và dạng không glycosyl hóa, 14,7 kDa.